Противосудорожная активность и активность по удалению свободных радикалов Gastrodia elata B1. у крыс, обработанных каиновой кислотой.

Источник материала: http://the-medical-dictionary.com/kainic_acid_article_2.htm

COPYRIGHT 2001 Institute for Advanced Research in Asian Science and Medicine COPYRIGHT 2001 Gale Group

Из Американского журнала китайской медицины, 22.03.01, Чинг-Лян Се.

Резюме: Gastrodia elata B1. (ГЭ) - это традиционная китайская трава, которая обычно используется в китайских общинах для лечения судорожных расстройств, таких как эпилепсия. Целью настоящего исследования было определение противосудорожной и свободнорадикальной активности ГЭ у крыс. Исследования in vitro проводились с использованием ткани мозга 6 самцов крыс Sprague-Dawley (SD), получавших 120 мкг / мл каиновой кислоты (КА) с добавлением или без добавления различных концентраций ГЭ. Исследования in vivo были проведены в общей сложности на 30 самцах крыс SD, разделенных на 5 групп по 6 крыс, которых лечили следующим образом: 1) нормальная группа получала внутрибрюшинную инъекцию (ip) PBS (фосфатно-солевой буфер, 1 мл / кг). ; 2) контрольная группа получала КА (12 мг / кг) внутрибрюшинно; 3) группа GE 1.0 получала пероральное введение GE 1.0 г / кг за 30 минут до введения КА;4) группа ГЭ 0,5 получала пероральное введение ГЭ 0,5 г / кг за 30 мин до введения КА; 5) группа ЛГ получала пероральное введение фенитоина 20 мг / кг за 30 мин до введения КА. Приступы подтверждались поведенческими наблюдениями, электроэнцефалографией (ЭЭГ) и электромиографией (ЭМГ). Уровни перекиси липидов в головном мозге крысы, хемилюминесценцию люминола (ХЛ) и люцигенин-ХЛ в периферической крови измеряли одновременно после поведенческих наблюдений. Результаты показывают, что введение ГЭ значительно снижает уровни КА-индуцированного пероксида липидов in vitro. Пероральное введение GE 1,0 г / кг и фенитоина 20 мг / кг значительно снизило количество дрожащих мокрых собак (WDS), тремора лап (PT) и миоклонии лица (FM) у крыс, получавших КА. Кроме того, пероральный прием ГЭ 1,0 г / кг значительно отсрочил начало WDS,от 30 минут в контрольной группе до 46 минут в группе 0,5 г / кг и 63 минуты в группе GE 1,0 г / кг. Значительно сниженный уровень перекисей липидов в головном мозге крыс был обнаружен в группах ГЭ 1,0 г / кг, 0,5 г / кг и фенитоина 20 мг / кг. Группа ГЭ 1,0 г / кг показала значительное снижение люминол-CL и люцигенина. -CL в периферической крови по сравнению с контрольной группой. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что ГЭ обладает противосудорожной активностью и улавливает свободные радикалы. Необходимы дальнейшие исследования для определения клинической эффективности ГЭ как противосудорожного средства у людей.Группа 0 г / кг показала значительное снижение количества люминола-CL и люцигенина-CL в периферической крови по сравнению с контрольной группой. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что ГЭ обладает противосудорожной активностью и улавливает свободные радикалы. Необходимы дальнейшие исследования для определения клинической эффективности ГЭ как противосудорожного средства у людей.Группа 0 г / кг показала значительное снижение количества люминола-CL и люцигенина-CL в периферической крови по сравнению с контрольной группой. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что ГЭ обладает противосудорожной активностью и улавливает свободные радикалы. Необходимы дальнейшие исследования для определения клинической эффективности ГЭ как противосудорожного средства у людей.

Gastrodia elata B1. (GE) - это традиционный китайский травяной препарат, используемый для лечения головокружения и судорожных расстройств. Предыдущее исследование показало, что ГЭ может подавлять повышение уровня перекиси липидов, вызываемое хлоридом железа у крыс, а также что ГЭ обладает эффектом улавливания свободных радикалов (Liu and Mori, 1992). Считалось, что эти эффекты ГЭ в основном являются результатом активности его активных компонентов, включая ванилин и п-гидроксибензиловый спирт (Liu and Mori, 1992, 1993).

Каиновая кислота (КА) - невротический аналог глутамата, обладающий сильным нейровозбуждающим действием. Несколько исследований продемонстрировали, что внутримозговая или внутрибрюшинная инъекция (ip) КА может вызывать лимбические двигательные судороги у крыс с поведением, в основном включающим тряску мокрой собаки (WDS), тремор лап (PT) и миоклонию лица (FM) (Schwob et al., 1980; Tremblay et al., 1984; Nitecka et al., 1984). Поведенческие проявления крыс, получавших КА, аналогичны проявлениям припадков височной доли у людей и, как полагают, являются результатом повреждения нейронов, главным образом, в гиппокампе и комплексе миндалины центральной нервной системы (Schwob et al., 1980; Tremblay et al. ., 1984; Nitecka et al., 1984; Wuerthele et al., 1978; Ben-Ari, 1985; Tanaka et al., 1988, 1990, 1992). Наши предыдущие исследования показали, что каиновая кислота ipможет вызывать повышение уровня перекиси липидов в головном мозге крысы и вызывать образование свободных радикалов кислорода в периферической крови (Hsieh et al., 1999a). Мы также обнаружили, что динамика WDS положительно коррелировала с уровнями перекиси липидов в головном мозге, хемилюминесценцией люминола (ХЛ) и количеством люцигенина-ХЛ в цельной крови крыс, получавших КА (Hsieh et al., 1999b). Предыдущие исследования продемонстрировали, что КА может вызывать патологические изменения, аналогичные изменениям при инфаркте головного мозга (Jorgensen et al., 1991; Liu et al., 1996), а также индуцировать повышение уровня перекиси липидов, предполагая, что, возможно, вызванное КА повреждение нейронов опосредовано свободными радикалами кислорода (Брюс и Бодри, 1995).Окислительный стресс может быть измерен в цельной крови с использованием сверхчувствительного хемилюминесцентного анализатора и усилителя люцигенина без выделения лейкоцитов, как сообщалось ранее (Sun et al., 1996, 1998).

Хотя ГЭ используется в китайских общинах как противосудорожное средство, механизм его противосудорожного действия остается неясным. Целью настоящего исследования было изучить противосудорожную активность и активность ГЭ по улавливанию свободных радикалов. Во-первых, мы изучили влияние ГЭ на KA-индуцированное перекисное окисление липидов в головном мозге крыс in vitro. Во-вторых, мы определили противосудорожный эффект ГЭ на судорожные припадки, вызванные КА. Наконец, мы измерили уровень свободных радикалов кислорода у крыс, получавших КА, с предварительной обработкой ГЭ или без нее. Приступы подтверждены поведенческими наблюдениями, записями ЭЭГ и ЭМГ. Подсчет WDS, PT и FM, а также время начала WDS использовали в качестве индикаторов противосудорожных эффектов. Одновременно измеряли уровни перекиси липидов в головном мозге крыс и количество люминола-CL и люцигенина-CL в цельной периферической крови.

Материалы и методы

Извлечение GE

ГЭ, использованный в этом исследовании, происходил из провинции Сычуань в Китае, был собран в сырой форме на Тайване и подтвержден Высшим институтом китайских фармацевтических наук Китайского медицинского колледжа, Тайчжун, Тайвань. Два кг сырого GE экстрагировали 4 раза 3 литрами 50% спирта. Экстракты фильтровали, замораживали и сушили, а затем хранили в сушильном шкафу. Общий выход составил 147 г (7,35%).

Экспериментальные процедуры

Взрослых самцов крыс SD весом 200-250 г помещали в группы по 3 крысы в ​​железные клетки и поддерживали 12-часовой цикл свет-темнота при температуре 25 ° C. Настоящее исследование было разделено на два эксперимента следующим образом: 1 ) измерение уровня перекиси липидов in vitro; и 2) наблюдение за поведением, записи электроэнцефалографа (ЭЭГ) и электромиографа (ЭМГ) и измерение уровней свободных радикалов in vivo.

Измерение уровня перекиси липидов in vitro

Шесть крыс были убиты под анестезией пентобарбиталом (50 мг / кг внутрибрюшинно). Мозг каждой крысы удаляли после транскардиальной перфузии 10 мл ледяного нормального физиологического раствора, а затем кору головного мозга отделяли от мозга. Кору головного мозга оттаивали и гомогенизировали в растворе Трис-HCl (pH 7,4), и гомогенаты центрифугировали при 3000 об / мин в течение 15 мин. Затем супернатант использовали для определения уровня перекиси липидов путем измерения концентрации малонового диальдегида (МДА). Либо GE 10 мг / мл, GE 1 мг / мл, GE 100 мкг / мл, GE 10 мкг / мл или витамин E 10 мМ добавляли, соответственно, к образцам после добавления KA (King Dom Co., Тайвань, 120 мкг / мл). Образцы инкубировали в течение 2 часов при 37 ° C с последующим добавлением 8,1% SDS и TBAR (2-тиобарбитуровая кислота + 20% уксусная кислота).Затем образцы снова инкубировали при 95 ° C в течение 1 часа и охлаждали до комнатной температуры, после чего добавляли 5 мл н-бутанола и центрифугировали при 3000 об / мин в течение 15 минут. Уровень MDA считывали при 532 нм (спектрофотометр, Beckman Instruments Inc., Калифорния, США). Стандартная кривая была построена с использованием известного количества эквивалента МДА в тех же условиях анализа, и результаты были рассчитаны как н моль / г ткани.

Наблюдения за поведением и записи ЭЭГ и ЭМГ

Всего 30 крыс были разделены на 5 различных групп по 6 крыс следующим образом: 1) нормальная группа получала PBS (фосфатно-солевой буфер, Sigma Co., США) 1 мл / кг внутрибрюшинно; 2) контрольная группа получала КА (12 мг / кг) внутрибрюшинно; 3) группа GE 1.0 получала пероральное введение GE 1.0 г / кг за 30 минут до введения КА; 4) группа ГЭ 0,5 получала пероральное введение ГЭ 0,5 г / кг за 30 мин до введения КА; 5) группа ЛГ перорально получала фенитоин (Sigma Co., США) в дозе 20 мг / кг за 30 мин до введения КА. За неделю до эксперимента записывающие электроды помещали под анестезию пентобарбиталом (50 мг / кг, внутрибрюшинно), фиксируя голову каждой крысы в ​​стереотаксическом аппарате. Был обнажен череп, и винты из нержавеющей стали были имплантированы на твердую мозговую оболочку над двусторонней сенсомоторной корой.Электрод сравнения помещали в лобную пазуху. Биполярные электрические провода, проходящие через подкожную клетчатку, помещали на мышцу шеи для регистрации ЭМГ. Эти электроды вставляли в разъем, а затем подсоединяли к устройству записи ЭЭГ и ЭМГ (MP 100WSW, BIOPAC System, Inc., Калифорния, США). Наблюдения за поведением и записи ЭЭГ и ЭМГ выполнялись непрерывно от 30 минут до введения лекарства до 3 часов после введения КА. Противосудорожные эффекты GE оценивали после введения KA с использованием общего количества WDS, PT и FM и времени начала WDS в качестве индикаторов. Тип приступа подтверждался поведенческими наблюдениями и наличием эпилептиформной активности на записях ЭЭГ и ЭМГ.Биполярные электрические провода, проходящие через подкожную клетчатку, помещали на мышцу шеи для регистрации ЭМГ. Эти электроды вставляли в разъем, а затем подсоединяли к устройству записи ЭЭГ и ЭМГ (MP 100WSW, BIOPAC System, Inc., Калифорния, США). Наблюдения за поведением и записи ЭЭГ и ЭМГ выполнялись непрерывно от 30 минут до введения лекарства до 3 часов после введения КА. Противосудорожные эффекты GE оценивали после введения KA с использованием общего количества WDS, PT и FM и времени начала WDS в качестве индикаторов. Тип приступа подтверждался поведенческими наблюдениями и наличием эпилептиформной активности на записях ЭЭГ и ЭМГ.Биполярные электрические провода, проходящие через подкожную клетчатку, помещали на мышцу шеи для регистрации ЭМГ. Эти электроды вставляли в разъем, а затем подсоединяли к устройству записи ЭЭГ и ЭМГ (MP 100WSW, BIOPAC System, Inc., Калифорния, США). Наблюдения за поведением и записи ЭЭГ и ЭМГ выполнялись непрерывно от 30 минут до введения лекарства до 3 часов после введения КА. Противосудорожные эффекты GE оценивали после введения KA с использованием общего количества WDS, PT и FM и времени начала WDS в качестве индикаторов. Тип приступа подтверждался поведенческими наблюдениями и наличием эпилептиформной активности на записях ЭЭГ и ЭМГ.а затем подключили к аппарату для записи ЭЭГ и ЭМГ (MP 100WSW, BIOPAC System, Inc., Калифорния, США). Наблюдения за поведением и записи ЭЭГ и ЭМГ выполнялись непрерывно от 30 минут до введения лекарства до 3 часов после введения КА. Противосудорожные эффекты GE оценивали после введения KA с использованием общего количества WDS, PT и FM и времени начала WDS в качестве индикаторов. Тип приступа подтверждался поведенческими наблюдениями и наличием эпилептиформной активности на записях ЭЭГ и ЭМГ.а затем подключили к аппарату для записи ЭЭГ и ЭМГ (MP 100WSW, BIOPAC System, Inc., Калифорния, США). Наблюдения за поведением и записи ЭЭГ и ЭМГ выполнялись непрерывно от 30 минут до введения лекарства до 3 часов после введения КА. Противосудорожные эффекты GE оценивали после введения KA с использованием общего количества WDS, PT и FM и времени начала WDS в качестве индикаторов. Тип приступа подтверждался поведенческими наблюдениями и наличием эпилептиформной активности на записях ЭЭГ и ЭМГ.и FM и время начала WDS в качестве индикаторов. Тип приступа подтверждался поведенческими наблюдениями и наличием эпилептиформной активности на записях ЭЭГ и ЭМГ.и FM и время начала WDS в качестве индикаторов. Тип приступа подтверждался поведенческими наблюдениями и наличием эпилептиформной активности на записях ЭЭГ и ЭМГ.

Измерение свободных радикалов in vivo

Уровни перекиси липидов в головном мозге крыс и количество люминола-CL и люцигенина-CL в цельной периферической крови измеряли одновременно после поведенческих наблюдений и записей ЭЭГ и ЭМГ. Образцы цельной крови (2 мл) получали путем транскардиальной пункции гепаринизированными пластиковыми шприцами под анестезией пентобарбиталом у каждой крысы. Образцы крови немедленно обертывали алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить воздействие света, и хранили в ледяном контейнере до тестирования на CL, которое обычно измеряли в течение 2 часов. Пробирку с 1 мл крови с ЭДТА использовали для подсчета лейкоцитов (WBC). После транскардиальной перфузии 10 мл ледяного физиологического раствора лобную кору, миндалину и гиппокамп извлекали из мозга, размораживали и гомогенизировали в растворе Трис-HCl pH 7,4.Затем гомогенаты центрифугировали при 3000 об / мин в течение 15 минут и супернатанты использовали для определения уровня перекиси липидов с помощью метода MDA, как описано выше.

Метод измерения люминол-ХЛ был аналогичен описанному ранее (Sun et al., 1998). Вкратце, 0,2 мл цельной крови смешивали с 0,1 мл PBS (pH 7,4) в специальной камере (модель CLD-110, Tohoku Electronic Indust. Co., Sendai Japan). Затем хемилюминесценцию измеряли в абсолютно темной камере системы анализа хемилюминесценции (Tohoku). Эта система включает детектор фотонов (модель CLD-110), счетчик хемилюминесценции (модель CLC-10), циркулятор воды (модель CH-201) и 32-битный персональный компьютер IBM. Через 200 секунд 1,0 мл 25 мкМ люминола (Sigma Co., США) в PBS вводили в ячейку из нержавеющей стали и непрерывно измеряли хемилюминесценцию образца крови. Через 600 секунд добавляли 0,2 мл зимозана-А (Sigma Co., США),и хемилюминесценцию образца крови измеряли непрерывно в течение всего 1020 секунд. Общее количество хемилюминесценции рассчитывали путем интегрирования площади под кривой и вычитания ее из уровня фона. Производство CL на WBC (лейкоциты) рассчитывали путем деления уровней CL в крови на количество лейкоцитов и выражали как CL / 1000 WBC.

Метод измерения люцигенин-CL был аналогичен описанному ранее (Sun et al., 1996, 1998; Chen et al., 1997). Вкратце, 0,1 мл PBS (pH 7,4) добавляли к 0,2 мл образца крови. Затем количество хемилюминесценции измеряли в абсолютно темной камере аналитической системы CL, как описано выше. Через 200 секунд в ячейку из нержавеющей стали вводили 1,0 мл 0,01 мМ люцигенина (Sigma Co., США) в PBS и непрерывно измеряли хемилюминесценцию образца крови. Через 600 секунд тем же методом добавляли 0,2 мл зимозана-А и непрерывно измеряли хемилюминесценцию образца крови в течение всего 1020 секунд. Общий CL и продукцию CL на WBC рассчитывали, как описано выше.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее [+ или -] стандартное отклонение. Для сравнения между группами использовался односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом Шеффе. Значение p [менее] 0,05 считалось статистически значимым.

Полученные результаты

Влияние ГЭ на КА-индуцированное перекисное окисление липидов in vitro

Уровень перекиси липидов увеличивался после введения КА in vitro (P [меньше] 0,001, рис. 1). Это увеличение ингибировалось GE 10 мг / мл, GE 1 мг / мл, GE 100 мкг / мл, GE 10 мкг / мл и витамином E 10 мМ / мл (P [меньше] 0,001, Фигура 1). GE 10 мг / мл и GE 1 мг / мл показали самое сильное ингибирование, за ним следовали GE 100 мкг / мл и GE 10 мкг / мл (рис. 1). Витамин Е (10 мМ / мл) имел значительно больший ингибирующий эффект, чем ГЭ 1 мг / кг, ГЭ 100 мкг / мл и ГЭ 10 мкг / мл (все P <0,01, рис. 1) ).

Влияние ГЭ на судорожные припадки, вызванные КА

У всех 24 крыс SD развились эпилептические припадки после внутрибрюшинного введения КА (12 мг / кг). Типы занятия включали WDS, PT и FM. У каждого типа припадка была своя характерная электрофизиологическая картина (рис. 2).

Пероральное введение как ГЭ 1 г / кг, так и фенитоина 20 мг / кг значительно снизило количество WDS (P [меньше] 0,001, рис. 3), PT (P [меньше] 0,001) и FM (P [меньше] менее] 0,05, фиг. 3) у крыс, получавших КА, но не было обнаружено аналогичного эффекта на FM у крыс, предварительно обработанных ГЭ 0,5 г / кг (P [больше] 0,05, фиг. 3). Время до начала WDS после введения КА увеличилось с 30 минут в контрольной группе до 46 и 63 минут в группе GE 0,5 и в группе GE 1,0 (P [меньше] 0,001, рис. 3), но фенитоин Группа с дозой 20 мг / кг не показала значительной задержки в начале WDS (P [больше] 0,05, рис. 3).

Влияние ГЭ на активность по улавливанию свободных радикалов у крыс, получавших КА, in vivo

Уровни перекиси липидов в лобной коре, миндалине и гиппокампе головного мозга крысы значительно увеличились после введения КА in vivo (P [меньше] 0,001, фиг. 4). Это увеличение было значительно подавлено пероральным введением ГЭ 1,0 г / кг, 0,5 г / кг или фенитоина 20 мг / кг (все P <0,001, рис. 4).

Количество люминола-CL в цельной крови увеличивалось после введения КА (P [меньше] 0,001, фиг. 5), и это увеличение было значительно ингибировано пероральным введением GE 1,0 г / кг (P [меньше] 0,001, Фигура 5), но не наблюдалось значительного ингибирования в группе ГЭ 0,5 г / кг и группе фенитоина 20 мг / кг (Р [меньше] 0,05, Фигура 5).

Количество люцигенина-CL в цельной крови также увеличивалось после введения КА (P [меньше] 0,001, рис. 5), и это увеличение значительно подавлялось пероральным введением либо ГЭ 1,0 г / кг, ГЭ 0,5 г / кг или фенитоин 20 мг / кг (все P [меньше] 0,001, рис. 5).

Обсуждение

ГЭ оказывает противосудорожное действие на крыс, получавших КА

Наши результаты показали, что у крыс развились судороги, включая WDS, PT и FM после введения KA. Эти результаты согласуются с нашим предыдущим исследованием и другими предыдущими исследованиями эффекта введения КА у крыс (Schwob et al., 1980; Tremblay et al., 1984; Nitecka et al., 1984; Hsieh et al., 1999a). Предыдущие авторы считали, что причиной этих припадков является в основном КА-индуцированное церебральное повреждение в областях гиппокампа и комплекса миндалины. Результаты настоящего исследования показывают, что пероральное введение GE 1,0 г / кг и фенитоина 20 мг / кг за 30 минут до введения KA значительно снижает частоту WDS, PT и FM. Кроме того, GE 1,0 г / кг отсрочил начало WDS с 30 минут в контрольной группе до 63 минут, предполагая, что GE оказывает противосудорожное действие у крыс, получавших КА.Эти результаты можно объяснить предыдущим исследованием, которое продемонстрировало, что связывание КА с рецепторами глутамата может быть ингибировано водным экстрактом ГЭ (Andersson et al., 1995). Lanthorn и Isaacson (1978) продемонстрировали, что развитие WDS имеет тесную связь с рецептором глутамата, поскольку его можно ингибировать с помощью агента, блокирующего рецепторы глутамата, такого как диэтиловый эфир глутаматной кислоты (GDEE).

ГЭ ингибирует КА-индуцированное перекисное окисление липидов in vitro

Мы обнаружили, что ГЭ оказывает подавляющее действие на KA-индуцированное перекисное окисление липидов в мозге крыс in vitro. Melchiorri et al. (1995) сообщили, что окислительное повреждение в различных областях мозга крысы может быть вызвано введением КА, следовательно, предполагая, что ГЭ обладает эффектом улавливания свободных радикалов у крыс, получавших ICA in vitro. Это открытие также аналогично предыдущему исследованию, показывающему, что ГЭ ингибирует повышение уровня перекиси липидов у крыс, получавших хлорид железа, in vitro (Liu and Mori 1992).

GE демонстрирует деятельность по очистке от свободных радикалов

Наши результаты показывают, что уровни перекиси липидов увеличиваются в областях лобной коры, миндалины и гиппокампа после введения КА. Эти результаты хорошо согласуются с двумя предыдущими исследованиями (Bruce and Baudry, 1995; Melchiorri et al., 1995). В нескольких исследованиях считалось, что повреждение нейронов, вызванное КА, опосредовано образованием свободных радикалов (Bruce and Baudry, 1995; Kim et al., 1997). В настоящем исследовании мы обнаружили, что повышение уровня перекиси липидов у крыс, получавших КА, значительно ингибировалось пероральным введением ГЭ 1,0 г / кг. ГЭ 0,5 г / кг или фенитоин 20 мг / кг. Этот эффект ГЭ очень похож на предыдущие данные о том, что ГЭ и его активные компоненты, включая п-гидроксибензиловый спирт и ванилин, оказывают подавляющее действие на индуцированное хлоридом железа перекисное окисление липидов в мозге крыс (Liu and Mori, 1992, 1993).

Наши результаты демонстрируют, что ГЭ 1,0 г / кг значительно снижает увеличение количества люминола-ХЛ и люцигенина-ХЛ в периферической крови, вызванное введением КА, предполагая, что ГЭ проявляет активность по улавливанию свободных радикалов, поскольку уровни люминола-ХЛ считаются чувствительными. индикатор производства активных форм кислорода, включая супероксид-анион, гидроксильные радикалы, перекись водорода и хлорноватистую кислоту (Kaever et al., 1992; Sun et al., 1996). Уровни люцигенина-CL могут быть созданы NADP (H) оксидазой в лейкоцитах и, в частности, представляют собой супероксид-анион (Gyllenhammar, 1987; Lu et al., 1996; Chen et al., 1997).

В заключение, результаты настоящего исследования демонстрируют, что ГЭ обладает противосудорожным действием и улавливает свободные радикалы. Необходимы дальнейшие исследования для определения клинической эффективности ГЭ как противосудорожного средства у людей.

Подтверждение

Это исследование было поддержано грантом Комитета китайской медицины и фармации, Департамента здравоохранения, Исполнительный Юань, Китайская республика, CCMP88-RD-020.

Добавить комментарий


Защитный код
Обновить